透射电镜/扫描电镜（编号：1309）
一、服务介绍
透射电镜，即透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM），以电子束为光源，可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2um的超微结构，放大倍数为几万到几十万倍。主要应用于物质内部的超微结构观察。
二、实验内容
1. 取材：组织块小于1立方毫米
2. 固定：2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。用 0.1M 磷酸漂洗液漂洗15min，3次。1%锇酸固定液固定2-3h。用 0.1M 磷酸漂洗液漂洗15min，3次
3. 脱水：50%乙醇15-20min ，70%乙醇15-20min，90%乙醇15-20min；90%乙醇90%丙酮（1:1）15-20min， 90%丙酮15-20min（以上在4℃冰箱内进行）。100%丙酮，室温15-20min，3次
4. 包埋：纯丙酮+包埋液（2:1）室温3-4h；纯丙酮+包埋液（1:2），室温过夜；纯包埋液37℃ 2-3h
5. 固化：37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12h，60℃烘箱内48h
6. 超薄切片机切片70nm
7. 3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
8. 透射电镜观察，拍片
三、客户提供
1．组织样本：将组织切成 1 立方毫米左右小块（扫描电镜取材可稍大于该标准） 固定于 2.5%戊二醛固定液。
2．运输：4度冰袋运输
3、需要明确具体观察指标及要求，并提供相关结果示例图
提示：
a．取离心好的细胞团块时，如细胞分散，可在离心管中注入约 5ul 血清后再次离心，至 EP 管底部出现致密细胞团块，即送电镜室。
b．细胞大小不同，最佳离心富集速率和时间不同。提前检索文献，避免反复离心损伤细胞。
四、公司提供
1. 实验操作步骤、设备、试剂
2. 原始透射电镜图片，倍数依据实际情况选择合适放大倍数，5-8张
五、取材要求：
取材是电镜样品制备的第一步，也是十分重要的一步。其操作成功与否直接关系到整个实验的成败。 为了得到好的结果，请务必认真做好最关键的第一步取材。因取材不规范导致实验失败本公司概不负责！取材基本要点：快（1min）、冷（4 ℃）、小（1mm 3 ）、净（无杂质）、准（部位准确）。
（1）细胞取材
1．确认细胞数量充足（150px 或 250px 皿长满），离心后在 ep 管中 绿豆大小；
2．新鲜配置的电镜专用 2.5%戊二醛固定液，PH值 7.3-7.4；
3．贴壁细胞用柔软细胞划子轻轻刮起成细胞悬液，尽量不要反复来回刮；
4．把细胞悬液置入洁净1.5ml尖头 PEP管；
5．选择合适的离心速度和时间离心，一般 1000rpm 至 3000rpm，5min 至 10min(转
速及洗的时间请根据具体情况具体分析，比较脆弱敏感的细胞，尽量低转速、短时间，
以细胞离心成团为准！S PBS洗的时间过长，容易造成自噬假阳性)；
6．取细胞团块，如致密团结即弃上清，注入新鲜 2.5%戊二醛固定液，4℃保存；
（2）组织取材：
1.定位准确：解剖水平的准确定位误差应≤1mm。注意各组实验动物取材区位及方位的一致性和代表性。
2.操作迅速：组织离开活体后，以最快的速度浸入戊二醛固定液，0.5 min 或最多2 min。事先准备好 1.5ml尖头 PEP管里面盛满预冷的2.5%戊二醛固定液。
3.标本尺寸大小：组织块大小需要在 1mm 3 左右，样品太大会导致样品固定不充分。（提示：把较大标本块修整成符合要求的颗粒时，须事先准备一个蜡盘，滴入戊二醛固定液，把标本浸在液滴中修整，确认每个小标本颗粒都包含需要的结构内容，用牙签挑出 3～5 粒标本，放入1.5ml尖头PEP管。）
4．保持低温环境：为降低自溶酶活性，最好在 4℃低温条件下取材，容器和器械预冷；将修整好的标本块放入戊二醛固定液后，普通 4℃冰箱保存。