细胞存活曲线测定（编号：1004）

一、实验介绍：

目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。

其中常见检测：CCK8检测法 ，MTT检测法，Brdu检测法，Edu检测法，平板克隆形成。

Cell Counting Kit-8 简称 CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8 (化学名: 2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐) 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8 属于 MTT 的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物 (formazan) 。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在 450 nm 波长处测定OD 值，间接反映活细胞数量。

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

二、实验流程：

客户提供细胞→细胞培养→细胞加药处理→加MTT/CCK8孵育→吸光度检测→数据分析

1、 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000-10000 孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。

2、 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反映真实情况。

3、 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4、 每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、 终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7、 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

三、客户提供：
客户需提供：足量样品、样品信息（如细胞类型、分子量、溶解性、稳定性、保存条件等）、相关实验设计内容（如样品作用时间、浓度等）、细胞株等。武汉市内可上门取样，外地需邮寄样本请提前咨询。

四、公司提供：

实验结果、IC50值及完整的实验报告。